・Triple CRISPR 法による交配無しでの完全両アリルノックアウトマウス作製( Cell reports 2016, Neuron 2016, Development 2017, Cell reports 2018)

　従来のノックアウト動物作成方法では、目的の完全ノックアウト動物（ホモ接合）を得るのに年単位の大変長い時間がかかってしまうのが問題でした。私達はCRISPR/Cas9法を応用し、新たなsgRNAデザイン方法と複数sgRNAを組み合わせることにより、交配することなく第一世代マウスのほとんどで完全両アリルノックアウト動物を得ることが可能になりました。 この方法により３ヶ月以内に遺伝子ノックアウトの正確な表現型を知ることができるようになりました。 この方法は遺伝子のダブルノックアウトやトリプルノックアウトにも応用可能で、第一世代マウスを用いて交配の手間なしでいきなり多重遺伝子変異マウスの表現型解析ができる画期的な方法です。 一例として、Chrm1, Chrm3 ダブルノックアウトマウスでREM睡眠が消失するという非常に興味深い現象がこの方法により迅速に発見されました（Niwa et al. 2018 Cell reports)。
今後この方法を応用して、有用動物の開発に役立つ候補遺伝子の迅速なスクリーニングを行っていきます。



図４ Triple CRISPR法による初代マウス完全ノックアウト（Tyrosinase遺伝子KOによる体色の消失）の実現



・Tol2 トランスポゾンシステムを応用したトランスジェニックマウス作製 (Genomics 2010, BMC genomics 2009, Cell struct. funct. 2012 [日本細胞生物学会論文賞（CSF Award）を受賞], J. Neuroscience 2013, J. Exp. Med. 2014, PNAS 2015, Cell reports 2015, Cancer Science 2017, Journal of Thrombosis and Haemostasis 2017, Cell reports 2017, Nature communications 2018, Scientific Reports 2018 etc. プロトコール実験医学)

　メダカ由来 DNA transposon の Tol2 システムを応用し、非常に効率よくトランスジェニックマウスを作製できる方法を確立しました（国立遺伝学研究所・川上浩一研究室との共同研究）。 アクティブ・トランスジェネシスと呼ばれるこの方法では、前核ではなくよりダメージが低減できる細胞質に高濃度の外来遺伝子とトランスポゼースを導入することができるため、高効率の遺伝子導入と高い生存率の両立が可能になります。 多くの場合、５０％以上の産仔に導入遺伝子が入ります（従来法の１０倍以上の効率です）。2010年に発表した細胞質インジェクションプロトコールはCRISPR/Cas9法にもそのまま応用が可能で、酵素のmRNAを細胞質に打つことで非常に高い生存率と良い導入効率を両立する方法の先駆けとなりました(Genomics 2010)。 従来のトランスジェニックマウスの問題点を解消したこの方法により導入遺伝子の安定した発現を得られるのが特長で、安定したFRET バイオセンサー発現マウスの世界に先駆けての樹立（Cell struct. funct. 2012, 京都大学・松田道行研究室との共同研究）など、これまでに多くの共同研究で成果を上げています。 Tol2システムは昆虫から哺乳類まで広範な動物で働くことが示されています。有用動物開発のための強力なツールとして役立ちます。





　

・ES細胞-マウス胚アグリゲーションデバイスによる100％ES 細胞由来マウス作製法 (PLOS ONE 2018)

　遺伝子改変ES細胞由来の遺伝子改変マウスを8細胞期のマウス胚とのをアグリゲーション法で作製することができますが、3i培地をES細胞培地に使用することで100%ES細胞由来のマウスを作製することが可能です。 この方法をさらに簡便にし、定量的な混合比を実現するため、田中陽・理研ユニットリーダー（当時）との共同研究でマイクロデバイスを開発しました。この方法は特別なスキル無しで100％ES細胞マウスを作製することができ、標準的な96穴プレートでの操作ができるため将来的にはロボットによる自動化へ応用が可能です。