初代培養肝細胞 Cell DNA量の定量

LabarcaとPaigenらの方法にしたがって測定した。Anal. Biochem. 102: 344-352, 1980.

試薬

PSB溶液
Na2HPO4･12H2O 1.7907g,NaCl 11.688gを水100mLに溶解した溶液に、NaH2PO4･2H2O 0.78g,NaCl 11.688gを水100mLに溶解した溶液を加えpHを7.4に調整する。
Hoechst H33258溶液
Hoechst H33258 (American Hoechst Corporation)を200μg/mLとなるように溶解する。
DNA標準液
ウシ胸腺DNA溶液(10mg/4mL)（ベーリンガーマンハイム山之内株式会社）を用いた。

方法

　初代培養肝細胞のホモジネート100μL PSB溶液 2885μlを加え、次いでHoechst H33258溶液15μLを加えよく混合した。室温に30分間放置した後、励起波長356nm,蛍光波長458nmにおける蛍光光度を測定した。標準はDNA標準液5μLにPSB溶液2975を加え、後はサンプルと同様の操作を行い蛍光光度を求める。得られた蛍光光度より、サンプルのDNA量を求める。

肝細胞の尿素合成能の測定

中村敏一著「初代培養肝細胞実験法」学会出版センター

試薬

5mM 塩化アンモニウムを含むハンクス液
発色試薬　　3.6mM チオセミカルバジド(thiosemicarbazide)
　　　　　　61.7mM アセチルモノオキシム(acetylmonoxime)
　　　　　　20% 硫酸
　　　　　　0.12M 塩化第二鉄を含む56.7%りん酸
　　　　　　酸混液　　　上記の硫酸とりん酸を999:1に混合したもの
標準尿素溶液　　10μg/mLの尿素溶液を調製する

測定方法

　60mmディッシュに培養した肝細胞の培地を捨て、PBSで洗浄後、5mM NH4Clを含むハンクス液（日水製薬；フェノールレッド不含）を加え、37℃で2時間インキュベートした。そのインキュベーション液をサンプルとした。
　標準尿素溶液あるいはインキュベーション液0.5mLを試験管にとり、1mLの発色試薬と1.5mLの酸混液を加え、沸騰水中で10分間の熱処理をした。冷却後、520nmの吸光度を測定した。　

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