水田土壌生態系各部位に生息する微生物のPhylogeny


はじめに

表面水、浸透水中の微生物

作土酸化層・還元層中の微生物

水稲根圏の微生物

稲ワラ中の微生物

堆肥化過程の微生物

水田生態系における生物多様性

文献





はじめに

 水田土壌生態系は、表面水層、作土層土壌、作土下の下層土、から構成され、作土層土壌はその酸化還元状態から表層数mmの作土酸化層その下の作土還元層から成り立っている。また、水田生態系においては、浸透水がこれら各層を上から下に結びつけている。表面水、作土酸化層・還元層、下層土、浸透水は、微生物にとってそれぞれ異なった生育環境である。
 加えて、作土層には、水稲根系が発達し、多量の刈り株・残根や稲ワラが鋤込まれ、これらの部位にもまた、特有の微生物群集が生育している。
 本研究では、水稲生育期間中における、1)表面水、2)作土酸化層、3)還元層、4)水稲根、5)植物遺体(稲ワラ)、6)浸透水、の各部位に生育する微生物群集を系統分類学の視点から比較し、その特徴を明らかにすることを試みた。
 なお、微生物群集の解析に当たっては、水田各部位から採取した試料中のDNA・RNAを抽出・生成し、各種微生物に特異的なプライマーを用いてPCR増幅した後、PCR産物を変成剤濃度勾配電気泳動法(DGGE法)により塩基配列の違いから分画して、DGGEバンドパターンから試料間の微生物群集構造の類似性を比較するとともに、特徴的なDGGEバンドを切り出し、塩基配列を解読して、試料に特徴的な微生物を推定した。

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表面水、浸透水中の微生物

表面水

 愛知県安城農業技術センター内の長期肥料連用試験圃場から定期的に表面水を採取し、DGGE法で施肥管理の違い、水稲生育時期に伴う真正細菌のDGGEバンドパターンの変化を確認したあと、主要なバンドの塩基配列を解読した結果、Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB)グループ、Alphaproteobacteria、Actinobacteriaに近縁であった。なお、これらの細菌は他の水環境でよく見出される細菌群集であることが、文献検索の結果明らかとなった(文献1)。

浸透水

 また、表面水中と浸透水中の微生物群集を比較した。水稲生育期間中数回、表面水と同時に作土直下の浸透水、下層土40 cm深の浸透水をそれぞれ採取し、DGGE法で群集構造を比較するとともに、特徴的なDGGEバンドの塩基配列を解読した結果、表面水中と40 cm深の浸透水中の真正細菌群集は互いに類似し、作土直下の浸透水中真正細菌群集とは異なっていた。また、各部位に特徴的なDGGEバンドの塩基配列解読の結果、表面水中と40 cm深の浸透水中の真正細菌群集は、陸水環境から分離された細菌と近縁であったの対し、作土直下の浸透水中真正細菌群集は鉄還元菌など嫌気的環境で見出されている細菌で特徴付けられることが判明した(文献2)。

ミジンコに共生する微生物

 水田田面水ミクロコズム中に生育させた5種類のミジンコ(Tanycypris sp. Moina sp. Mesocyclops sp. Cypretta sp. Heterocypris sp.)に共生する細菌群集を、16S rDNAを対象にPCR-DGGE法により解析した結果、いずれのミジンコにおいてもDGGEバンド数は少なく、特異な細菌群がミジンコと共生して生育していることが伺われた。また、ほとんどすべての共生細菌はグラム陰性細菌、とくにCytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB)群に属した(文献3)。次いで、Moinaに注目して稲ワラや堆肥施用の影響を調査したところ、施用の有無にかかわらず、細菌群集は主にCytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB)群、Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, およびGammaproteobacteria 群に属していた。稲ワラや堆肥施用の影響は顕著でなく、むしろCytophagales細菌がMoinaに特徴的な細菌であることが判明した(文献4)。さらに、水田圃場から3種類のミジンコを採取し、共生するアンモニア酸化細菌、メタン酸化細菌、メタン生成古細菌をDGGE解析した結果、アンモニア酸化細菌としてはBetaproteobacteriaに属する細菌が、メタン酸化細菌としてはMethylomicrobium, Methylococcusの存在が推察された。他方、メタン生成古細菌の存在は確認されなかった(文献5)。

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作土酸化層・還元層中の微生物

 湛水状態の水田土壌表層部に生育するアンモニア酸化細菌の種類を明らかにするために、湛水培養した水田土壌を表層から数mm単位で分別採取した後、PCR-DGGE解析した。その結果、Nitrosomonas, Nitrosospiraに近縁なアンモニア酸化細菌の存在が推察された(文献6)。また、安城農業技術センターに加えて九州沖縄農業研究センター筑後試験地の水田土壌中に生育するメタン生成古細菌をPCR-DGGE法で分画し、41本のバンドの塩基配列を解読した結果、Methanomicrobiales, Methonosarcinales, Rice cluster Iに属すことが明らかとなった(文献7)。次いで、両圃場から、湛水期に7回、落水期に6回土壌を採取し、DGGEバンドパターンを比較した結果、バンドパターンに顕著な季節変動は観察されず、バンドパターンの違いは主に圃場間の違いに由来していた。この結果は、落水期にもDNAで評価する限り、メタン生成古細菌は土壌中で安定に生息していることが示唆された。なお、両圃場に生育する主要なメタン生成古細菌は、Methanomicrobiales, Methanosarcinales, Methanosaetaceae, Rice cluster Iであった(文献8)。

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水稲根圏の微生物

 水稲においては、葉と根が株元のヤ節ユと呼ばれる部位から伸長し、水稲の生育に伴う新たな節の形成に伴って新しい葉と根が発達する。通常第n番目の"節"から伸長した葉と根は第(n+1)番目の"節"の葉と根に比べて5〜7日古い。そこで、安城土壌を用いてポット栽培した水稲を定期的に採取し、各節根に生息する細菌群集を、PCR-DGGE法およびDGGEバンドのシークエンスにより解析を行った。その結果、細菌群集は節根間よりもむしろ水稲生育ステージで大きく変化し、節根間においても細菌群集は規則的に変化しており、上位節根から下位節根に向けての根環境の変化が示唆された。多くの節根に共通するDGGEバンド、各生育ステージに特徴的なDGGEバンド、節根間で変化したDGGEバンドについて塩基配列を決定し、データベースによって近縁細菌を調べたところ、好気性菌および偏性嫌気性菌が、多くの節根に共通する近縁細菌として得られ、水稲根は、酸化的部位と還元的部位が混ざり合う不均一な環境であることが推測された。また、近縁細菌として得られた嫌気性菌は、生育ステージの移行に伴い、上位節根から下位節根に向けて増加しており、水稲根における還元的部位の増加が伺われた(文献9)。なお、同一の根試料において、Nitrosospiraが水稲根における主なアンモニア酸化細菌であることが推定された(文献10)。

 各節根に生息する真核生物としては、生育初期の第1節根で他の節根に比べて多くのバンドが認められ、畑苗代期の水稲根に多様な真核生物が付着していたとともに、移植後も鞭毛虫、繊毛虫、緑藻類、糸状菌といった真核生物が、引き続き水稲根で生息することが推察された。なお、生育初期・後期を特徴付けるDGGEバンドとして糸状菌が見出され、移植後伸長した水稲根で生息する真核生物は糸状菌であると推察された(文献11)。さらに、各節根に生息するメタン生成古細菌のDGGEパターンは、水稲生育ステージおよび節位の違いに関わらず類似しており、水稲根には特定のメタン生成古細菌が生息していることが示唆された。なお、バンドの全てがMethanomicrobialesあるいはメタン生成古細菌のRice cluster Iに近縁であった(文献12)。また、岩手県雫石に設置されたFACE圃場において、大気CO2の増加が水稲根に生息するメタン生成古細菌群集に及ぼす影響を調査した結果、DGGEバンド数は生育ステージの進行に伴い増加する傾向が認められた。DGGEバンドの近縁種はすべてMethanomicrobialesとRice cluster Iに属し、特徴的なバンドの近縁種の系統関係にはFACEによる影響は認められなかった(文献13)。

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稲ワラ中の微生物

 水田圃場に埋設した稲わらの分解過程に関与する真正細菌群集のDGGEバンドパターンは、大きく葉鞘と葉身で分かれ、さらに埋設後の時間経過にともない変化した。これらの群集を特徴づけるDGGEバンドの塩基配列を解読した結果、多くのバンドがAlphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria、CFB group、Spirochaetesと近縁関係を示し、数本のバンドはAcidobacteriaやVerrucomicrobiaに近縁であった。CFB groupとa-Proteobacteriaは葉鞘と葉身の両部位に共通してみられた。また、Proteobacteria、CFB group、Spirochaetesが水田土壌中の稲わらの分解過程に関与すると推測された(文献14)。他方、メタン生成古細菌のDGGEバンドは、葉鞘と葉身ともに中干し前後で大きく区分され、両者間のバンドパターンの違いはわずかであった。なお、落水期に埋設した土壌中ではDGGEバンドが確認できなかった。また、稲ワラに生育するメタン生成古細菌は、中干し前にはMethoanomicrobiales, Rice cluster I, Methanosarcinalesにより、中干し後にはMethoanomicrobialesにより特徴付けられた(文献15)。

 さらに、稲作期間における稲ワラ堆肥の土壌中での分解に関与する真正細菌群集をDNAとRNAのDGGEバンドパターンから推定した。DNAのDGGEバンド数は期間中ほぼ一定であったが,RNAのDGGEバンド数は中干し前よりも後で少なく,稲ワラ堆肥中の細菌群集は中干し以外の期間には徐々に変化し,中干しにより影響されることが明らかになった。稲ワラ堆肥には,Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, CFB group, Chlorobia, Verrucomicrobia, Chloroflexi, Spirochaetes, Firmicutes (clostridia)およびActinobacteiaが存在した。中干しの前と後で特徴的にメ活性のあるモ菌はそれぞれClostridium, Acinetobacter (g-Proteobacteria), b-ProteobacteriaおよびFlavobacterium, Chondromyces, Chloroflexi, Deltaproteobacteriaであり,全期間にわたって"活性のある"菌はSpirochaeta, myxobacteriaであった(文献16)。

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堆肥化過程の微生物

 堆肥化過程の稲ワラのDGGEバンドパターンは原料の稲ワラと比較してより複雑であり,バンド数が多かった。統計的解析の結果,原料および堆肥化過程の稲ワラのDGGEバンドパターンは堆肥化処理前,高温期,中間期,腐熟期の4つのグループに分かれ,堆肥化処理前はAlphaproteobacteria,高温期は高温性Bacillus spp.と放線菌,中間期と腐熟期はCytophagaClostridium群と,異なる細菌群がそれぞれのステージを特徴づけていた。さらに,中温性のBacillus群が堆肥化過程を通じて常に存在した(文献17)。真核生物のDGGEバンドパターンも4つに区分され、真正細菌群集のバンドパターンと一致した。稲ワラ材料を特徴付ける真核生物は子嚢菌、高温期は原生動物Apicomplexaと子嚢菌、中熟期は子嚢菌、担子菌、3種の原生動物Opalozoa, Ciliophora, Leptomyxida、センチュウ、Stramenopilesであり、完熟期は子嚢菌、接合菌、卵菌類、藻類のHaptophyceaeとChrysophyceae、センチュウであった(文献18)。

 また、稲ワラの堆肥化過程におけるメタン生成古細菌群集のDGGEバンドパターンは、3つに大別され、1番目のDGGEバンドパターンは,おそらく土壌からの混入によるものと考えられた。2,3番目のDGGEバンド群は,堆肥化の中期および後熟期に出現し,稲ワラの嫌気的分解に関与した群集を特徴付けるものと推察された。塩基配列の解読の結果は、Methanomicrobiales, Rice Cluster I, Methanosarcinalesに近縁であった(文献19)。

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水田生態系における生物多様性

 以上、水田生態系各部位には、互いに異なる微生物群集が生育し、水稲の生育に伴って季節変動、各部位の微生物群集を特徴付ける微生物の系統関係を要約した。表1は、以上に紹介した成果の中で、真正細菌のDGGEバンドパターンの特徴を各部位について相互比較したものである。異なるバンドの総数は植物遺体,水田土壌中に埋設した稲ワラおよび水田土壌表面に設置した稲ワラで多く,これらの部位でphylotype(系統型)数が多いことを示していた。バンドパターンの多様性と変化の程度を比較したところ,作土および土壌中に埋設した稲ワラ堆肥の真正細菌群集は多様性が高く安定であったのに対し,水田土壌表面に設置した稲ワラおよびミジンコの群集は多様性が低くかつ変化が激しいことが示された。また,各部位の真正細菌のDGGEパターンより得られた250のバンドの塩基配列と202菌株の代表的な真正細菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列との間の系統遺伝的距離に基づいた主成分分析により,それぞれの部位の群集が互いに異なりかつ特異的であることが示された。

表1.水田生態系各部位に生息する真正細菌群集の特徴

異なるバンド総数(本)
多様性指数(Shannon-Wiener指数)
パターンの安定性指数
植物遺体
97
1.63
0.62
作土
52
2.59
0.62
土壌中に埋設した稲ワラ
78
1.56
0.30
稲ワラの堆肥化過程
56
1.84
0.42
田面水(有機物連用圃場)
50
1.69
0.38
水稲根
54 1.53 0.35


土壌中に埋設した稲ワラ堆肥
36 2.16 0.54


田面水(A2圃場)
45 1.85 0.45


浸透水
47 1.29 0.37


土壌表面の稲ワラ
61 0.83 0.21


ミジンコ
29 0.52 0.16




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文献

1. Taketoshi Shibagaki-Shimizu, Natsuko Nakayama, Yasunori Nakajima, Kazuo Matsuya, Makoto Kimura, and Susumu Asakawa: Phylogenetic study on bacterial community in the floodwater of a Japanese paddy field estimated by sequencing 16S rDNA fragments after denaturing gradient gel electrophoresis. Biol. Fertil. Soils, 42(4), 362-365 (2006)

2. Jun Murase, Miho Shimizu, Motoki Hayashi, Kazuo Matsuya, and Makoto Kimura : Comparison of bacterial communities in percolating water from plow layer and subsoil layer of a Japanese paddy field estimated by PCR-DGGE. Soil Sci. Plant Nutr., 51(1), 83-90 (2005)

3. Ainin Niswati, Jun Murase and Makoto Kimura : Comparison of bacterial communities associated with microcrustaceans from the floodwater of a paddy field microcosm: estimation based on DGGE pattern and sequence analyses. Soil Sci. Plant Nutr., 51(2), 281-290 (2005)

4. Ainin Niswati, Jun Murase, and Makoto Kimura : Effect of application of rice straw and compost on the bacterial communities associated with Moina sp. in the floodwater of a paddy soil microcosm: estimation based on DGGE pattern and sequence analyses. Soil Sci. Plant Nutr., 51(4), 565-571 (2005)

5. Ainin Niswati, Jun Murase, Susumu Asakawa, and Makoto Kimura: Analysis of communities of ammonia oxidizers, methanotrophs, and methanogens associated with microcrustaceans in the floodwater of a rice field microcosm. Soil Sci. Plant Nutr., 50(3), 447-455 (2004)

6. Jun Murase, Kumiko Itoh, Mayuko Kano and Makoto Kimura: Molecular analysis of b-Proteobacterial ammonia oxidizer populations in a submerged paddy soil microcosm. Soil Sci. Plant Nutr., 49(6), 909-913 (2003)

7. Takeshi Watanabe, Susumu Asakawa, Asumi Nakamura, Kazunari Nagaoka, and Makoto Kimura : DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil. FEMS Microbiol. Lett., 232, 153-163 (2004)

8. Takeshi Watanabe, Makoto Kimura, and Susumu Asakawa: Community structure of methanogenic archaea in paddy field soil under double cropping (rice-wheat). Soil Biol. Biochem., 38(6), 1264-1274 (2006)

9. Makoto Ikenaga, Susumu Asakawa, Yoshitetsu Muraoka and Makoto Kimura : Bacterial community associated with nodal roots of rice plants along with the growth stages: Estimated by PCR-DGGE and sequence analyses. Soil Sci. Plant Nutr., 49(4), 591-602 (2003)

10. Makoto Ikenaga, Susumu Asakawa, Yoshitetsu Muraoka and Makoto Kimura : Phylogenetic study on ammonia-oxidizing b-Proteobacteria associated with rice roots grown in a flooded paddy soil. Soil Sci. Plant Nutr., 49(5), 719-727 (2003)

11. Makoto Ikenaga, Susumu Asakawa, Yoshitetsu Muraoka, and Makoto Kimura : Community structure of eukaryotes in rice roots estimated by PCR-DGGE pattern and sequence analyses. Soil Sci. Plant Nutr., 50(4), 583-589 (2004)

12. Makoto Ikenaga, Susumu Asakawa, Yoshitetsu Muraoka, and Makoto Kimura : Methanogenic archaeal communities in rice roots grown in flooded soil pots: estimation by PCR-DGGE and sequence analyses. Soil Sci. Plant Nutr., 50(5), 701-711 (2004)

13. Tomoko Hashimoto-Yasuda, Makoto Ikenaga, Susumu Asakawa, Han-Yong Kim, Masumi Okada, Kazuhiko Kobayashi, and Makoto Kimura : Effect of free-air CO2 enrichment (FACE) on methanogenic archaeal communities inhabiting rice roots in a Japanese rice field. Soil Sci. Plant Nutr., 51(1), 91-100 (2005)

14. Atsuo Sugano, Hidetaka Tsuchimoto, Cho Cho Tun, Susumu Asakawa, and Makoto Kimura : Succession and phylogenetic profile of eubacterial communities in rice straw incorporated into a rice field: estimation by PCR-DGGE analysis. Soil Sci. Plant Nutr., 51(1), 51-60 (2005)

15. Atsuo Sugano, Hidetaka Tsuchimoto, Cho Cho Tun, Makoto Kimura, and Susumu Asakawa : Succession of methanogenic archaea in rice straw incorporated into a Japanese rice field: estimation by PCR-DGGE and sequence analyses. Archaea, 1(6), 391–397 (2005)

16. Takanori Tanahashi, Jun Murase, Kazuo Matsuya, Susumu Asakawa, and Makoto Kimura : Bacterial community responsible for the decomposition of rice straw compost in a Japanese rice paddy field as determined with denaturing gradient gel electrophoresis of amplified 16S rDNA and 16S rRNA fragments. Soil Sci. Plant Nutr., 51(3), 351-360 (2005)

17. Vita Ratri Cahyani, Kazuo Matsuya, Susumu Asakawa and Makoto Kimura : Succession and phylogenetic composition of bacterial communities responsible for composting process of rice straw estimated by PCR-DGGE analysis. Soil Sci. Plant Nutr., 49(4), 619-630 (2003)

18. Vita Ratri Cahyani, Kazuo Matsuya, Susumu Asakawa, and Makoto Kimura: Succession and phylogenetic profile of eukaryotic communities in the composting process of rice straw estimated by PCR-DGGE analysis. Biol. Fertil. Soils, 40, 334-344 (2004)

19. Vita Ratri Cahyani, Kazuo Matsuya, Susumu Asakawa, and Makoto Kimura : Succession and phylogenetic profile of methanogenic archaeal communities during the composting process of rice straw estimated by PCR-DGGE analysis. Soil Sci. Plant Nutr., 50(4), 555-563 (2004)


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