水田土壌の機能と微生物群集構造

はじめに

窒素代謝に関連する微生物群集
1)有機態窒素の無機化
2)硝化と脱窒
3)窒素固定

メタン生成に関与する微生物群集

おわりに

文 献







はじめに

 水田には洪水防止,水涵養,水質浄化,気温緩和,景観維持など多面的な機能30)が知られているが,最も重要な機能と役割はいうまでもなく,水稲の生産である。水田土壌の物理的・化学的・生物的な種々の作用や働きが水稲の生産を支えている。それらの水田土壌の働きの中で,無機養分としての窒素の供給や稲わら・堆肥といった有機物の分解など,土壌微生物の活動が重要な役割を果たしている場面は少なくない。

 水田は,水稲の栽培期間中,湛水されることが,他の農耕地とは著しく異なる点である(図1)。湛水にともなって生じる作土の還元化と表面水(田面水)の存在は,他の耕地土壌には見られない水田土壌生態系の特徴であり,水田土壌で生じる物理的・化学的・生物的な作用だけでなく,生息する微生物群集にも大きな影響を及ぼす25)


図1 水田生態系の構造(模式図)


 ここでは,水稲生産を支える土壌の機能として,最も重要な無機養分である窒素の形態変化に注目し,水田土壌における窒素代謝に関連する様々な微生物群集の研究例を紹介する。それとともに,還元的な土壌中における特徴的な物質代謝として,有機物分解の最終過程に位置づけられるメタン生成を取り上げ,反応に関わる微生物群集について,これまでの研究事例を紹介する。これらの研究の中で,それぞれの代謝の鍵となる微生物群や,反応に重要な役割を果たしている微生物間の相互作用について,明らかにされた知見と未解明のまま残されている点をも含めて述べたい。

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窒素代謝に関連する微生物群集

1)有機態窒素の無機化

 土壌中の有機態窒素から生じた無機態窒素は,水稲が吸収する窒素量の半分程度を占めており27,44,50),地力窒素と呼ばれる。そのため,地力窒素の発現量と無機化パターンの把握は水稲の栽培・施肥管理にとって重要であり,古くから現在まで数多くの研究が行われてきた34)。地力窒素の主要な給源は,微生物バイオマスに由来するタンパク態と考えられている。したがって,土壌中のバイオマス窒素の無機化は,主として,タンパク質のプロテアーゼ分解によるアミノ酸生成とそれに続く,アミダーゼ,リアーゼ,オキシダーゼなどによるアミノ酸からのアンモニア生成とみなすことができる。このうち,第一段階を触媒するプロテアーゼが,硝化・脱窒を含むそれ以降の反応速度を律速する鍵酵素と考えられている14,15)

 このように,有機態窒素の無機化あるいは地力窒素の発現,特に第一段階のタンパク態窒素のプロテアーゼ分解は水稲生産にとって極めて重要な過程であるが,これらの代謝を担う微生物群集は全くといっていいほど研究されていない。唯一の例が,渡邊らにより行われた,土壌プロテアーゼ生産微生物に関する一連の研究56〜63)である。水田土壌のプロテアーゼの主な供給源が細菌であるとの知見13,16)に基づき,細胞外プロテアーゼ生産能の高い菌株の分離に有効なアゾコール平板培地59)を用いて,水稲栽培期間に水田土壌からプロテアーゼ生産性の細菌・放線菌の分離を行ったところ,得られたプロテアーゼ生産菌の大部分がBacillus属細菌であった56)。さらに,これらの分離株の中で,高い酵素生産能を持つBacillus属菌株のプロテアーゼの酵素学的特性が,水田土壌から抽出したプロテアーゼの酵素特性とよく一致したこと57,58),水稲栽培期間中の水田土壌におけるプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌の動態とプロテアーゼ活性の変動の間に有意な相関が認められたこと60)より,水田土壌のプロテアーゼ生産を担う主要な微生物群がBacillus属細菌であると結論した。また,Bacillus属細菌の増殖時(栄養細胞)と胞子形成期で生産されるプロテアーゼのタイプが異なり,Bacillus属細菌の形態変化が土壌プロテアーゼ活性の制御機構の一つであると推定された62)。上述したように,水稲の吸収窒素量の半分程度を供給するため,水稲生産のために最も重要な水田土壌の機能といっても過言ではない地力窒素の発現に関し,その鍵微生物群を明らかにした極めて重要な知見である。

2)硝化と脱窒

 酸化層,還元層およびその境界を含む水田表層部における硝化・脱窒現象は施肥窒素の肥効に関わる重要な代謝過程であり,塩入松三郎・青峰重範42,43)により発見され,深層施肥あるいは全層施肥法の開発へとつながったことは有名である。

 硝化の第一段階はアンモニアから亜硝酸を生成するアンモニア酸化作用であり,主として独立栄養性のアンモニア酸化細菌により行われる17,26)。アンモニア酸化の第一段階(アンモニアのヒドロキシルアミンへの酸化)を触媒するアンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子(amoA)およびBetaproteobacteriaに属するアンモニア酸化細菌(NitrosospiraNitrosomonas)を対象とした16S rRNA遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーが開発され,様々な環境中における独立栄養性アンモニア酸化細菌の群集構造が解析されている26)。愛知県安城農業技術センターの水田圃場あるいは同圃場の水田土壌を用いたポット試験・ミクロコズム実験より得られた試料(作土21),稲わら20),田面水39),土壌表層33,39),水稲根18),ミジンコ35))について,これらのPCRプライマーを用いたDGGE解析を行ったところ,既知の菌株とは類縁性が低い一部の断片以外は全てNitrosospiraに近縁であった(図2)。水田生態系では,Nitrosospiraに近縁なアンモニア酸化細菌が主要であることを示しており,水田以外の土壌生態系におけるこれまでの多くの研究結果と一致した17,26)



図2 水田生態系を構成する各部位に生息するアンモニア酸化細菌のDGGE解析により得られた配列の系統関係。a. amoA配列に基づく系統樹,b. 16S rDNA配列に基づく系統樹。系統樹は近隣結合法により作成した。


 硝化の第二段階は亜硝酸の硝酸への酸化で,Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina, Nitrospiraが亜硝酸酸化細菌として知られている41,47)。これらはそれぞれ,alphaおよびgammaサブグループのProteobacetria門,Acidobacteriaに近縁な未確定の分類群(当初はDeltaproteobacteriaとされていた),Nitrospira門と,系統的に離れた分類群に属している41)。また,分離培養が難しく,分離例が少ないこともあり,環境中における亜硝酸酸化細菌の群集解析手法は一般的なものとなっていないが,最近になって排水処理系,水環境,底質などではNitrospiraの重要性が認識されつつある41)。培養法を用いた研究も含め,水田土壌に生息する亜硝酸酸化細菌群集はほとんど明らかにされていないが,水田の作土22)や植物遺体29)に生息する真正細菌全体を対象としたDGGE法による解析では,Nitrospiraに近縁な配列が得られている。水田土壌においてもNitrospiraが亜硝酸酸化細菌の主要な菌群であることが示唆されるが,さらにデータを蓄積する必要があろう。

 脱窒は硝酸あるいは亜硝酸が酸素の代わりに呼吸のために電子受容体として利用され,一酸化窒素,一酸化二窒素(亜酸化窒素),分子状窒素へと還元される嫌気的な過程であり,細菌および糸状菌を含む広範囲の通性嫌気性微生物(脱窒菌)により行われる17)。各過程の酵素群とコードする遺伝子がPseudomonasなどの代表的な菌株を用いて明らかにされており17,65,66),これらの酵素遺伝子,特に亜硝酸還元酵素(Nir)や一酸化二窒素還元酵素(Nos)の特定のサブユニットをコードする遺伝子に対する特異的プライマーを用いて,様々な環境中の脱窒菌群集の解析が行われている5,8,48)。水田土壌の脱窒菌群集を解析した研究はこれまでのところ見当たらないが,これらの手法を用いた分子生態学的研究が今後進むものと期待される。一方,分離・培養法の改良により,畑下層土では,系統的に既知の脱窒菌とは類縁性の低い菌株を含む低栄養性の脱窒菌群が主要であったとの報告12)があり,水田土壌でも脱窒菌の培養・分離を併せて行う必要があろう。

3)窒素固定

 水田の田面水と作土の最表層部には光合成窒素固定微生物が生息している23,55)。これは,耕地土壌における窒素固定菌の分布や生態面からみた場合,水田の特徴といえよう。中でもシアノバクテリア(ラン藻)による窒素固定が古くから注目され,水田土壌の窒素肥沃性維持に重要な役割を果たしていると考えられている3,51)。シアノバクテリアによる窒素固定量は一作当たり数〜80 kgN ha-1とされ38),九州農試(筑後市)の水田圃場における測定例では,約25 kgN ha-1の値が報告されている36)。培養や観察によって水田にはTolypothrix, Anabaena, Nostoc, Calothrixなどのシアノバクテリアが生息することが明らかにされている53,54)が,このような生態学的研究よりはむしろ,接種や窒素固定量の把握と水稲への効果などシアノバクテリアの利用に重点を置いた研究が数多く行われてきた3,24,38,51,55)。最近,シアノバクテリアの16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いたDGGE法により,水田作土のシアノバクテリアの群集構造が解析され,Subsection I〜IVに属するシアノバクテリアが得られている45)。水田の作土表層部に施用された稲わらを対象にして,同様の手法を用いて行った解析では,Subsection IIIおよびIVの糸状体シアノバクテリアが主として検出された4)

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メタン生成に関与する微生物群集

 メタン生成は還元条件下の作土での有機物の嫌気的な最終分解過程として古くから研究されており,近年では温室効果ガスの発生過程としても注目されている2)。メタン生成は絶対嫌気性のメタン生成古細菌により行われる。水田土壌に生息するメタン生成古細菌としては,これまでに表1に示した属の菌株が分離されており,目(Order)としては,Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanomicrobialesに属する菌群であった1,10,31,32,49)。遺伝子を用いた解析では,これら3目に加えて,既知の培養菌の分類群と類縁性の低い,Rice cluster Iと呼ばれる配列群が得られており11,64),これらが水田土壌のメタン生成古細菌の主要な菌群であると考えられる。なお,ごく最近Rice cluster Iに属するメタン生成古細菌が培養・分離された19)

表1 水田土壌から分離されたメタン生成古細菌の種類



Methanobacteriales
Methanobacterium

Methanobrevibacter
Methanosarcinales
Methanosarcina

Methanosaeta
Methanomicrobiales
Methanoculleus

Methanospirillum


 メタン生成反応はメタン生成古細菌単独で進行するばかりでなく,様々な嫌気微生物との共生系によっても進行する。その中で,最も有名な例はモMethanobacillus omelianskii 6)で,メタン生成古細菌と水素生成真正細菌との水素を介した種間水素転移と呼ばれる栄養共生関係に基づくメタン生成共生系である40)。水田土壌においても,プロピオン酸などからこのような共生系を介して生成される水素が,メタン生成反応に重要な役割を果たしていると考えられている9)。最近,水田土壌でプロピオン酸を分解する共生系の微生物群集を安定同位体プロービング(SIP)法により解析した研究28)が報告されたが,関与する微生物の分離培養が困難なこともあり,群集を構成する微生物についての知見は未だ十分ではない。森田ら(未発表)はプロピオン酸を基質とした培地に水田土壌を接種し,継代培養を行って得られた集積培養液について,DGGE法により培養液中に存在する真正細菌群集を解析した。SyntrophomonasSyntrophobacterなど,これまでに酪酸やプロピオン酸などの低級脂肪酸を分解するメタン生成共生系で知られている水素生成真正細菌群40)に近縁な配列は得られなかったものの,Bacteroidetesに属するProteiniphilum acetatigenesに近縁な配列が得られた。P. acetatigenesは,プロピオン酸を分解する, Syntrophobacter sulfatireduenceMethanobacterium formicicumからなるメタン生成共生系から得られた菌株で,自身はプロピオン酸の分解もメタンの生成も行わないが,この共生系に共存することにより,プロピオン酸分解とメタン生成を促進することが明らかにされている7)。DNA解析のみからの推定であるため,さらに研究が必要であるが,水田土壌のプロピオン酸分解共生系においても同様の共生的ともいえる相互作用が働いている可能性を示唆する結果である。これまで,共生では二者生物間の関係が主に研究されてきたが,このような三者の微生物からなる共生的な相互作用が,メタン生成共生系のみならず,水田土壌の様々な代謝に関与しているのかもしれない。

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おわりに

 窒素代謝とメタン生成という,水田土壌では古くから多くの研究が行われてきた代謝過程を中心に述べたが,鍵となる微生物群や反応に関わる相互作用について,亜硝酸酸化・脱窒やメタン生成共生系の例のように,不明な点もまだ多く残されている。加えて,嫌気的アンモニア酸化46)や硫酸イオン52)及び硝酸イオン37)の還元と共役した嫌気的メタン酸化など新たな反応経路や共生系が近年になって他の嫌気生態系で見つかっており,水田土壌でもこれらの微生物反応が行われているか,また,どのような微生物群が関わっているのか興味深い。今後の研究の進展に期待したい。分子生態学的手法の発達により微生物群集構造の解析はかつてより容易に行えるようになった。一方で,土壌中における機能や微生物間の相互作用を明らかにするためには,上記のプロテアーゼ生産菌やRice cluster Iに属するメタン生成古細菌,あるいは畑下層土における低栄養性脱窒菌などのように,菌の分離・培養を併せて行っていく必要があろう。

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文 献
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